・Real-time PCR Master Mix
・TaqManプローブ
・SYBR Green
・解離曲線
・鋳型DNAとしての逆転写産物の持ち込み量
・Real-time PCR Master Mix
PCR産物を定量的に解析できるリアルタイムPCRを行うための試薬が混合されたもの。リアルタイムPCRを行うために必要な試薬として、鋳型DNAとプライマー以外のものが含まれていると考えればよい。
※ 定量的PCR（Wikipedia）
・TaqManプローブ
PCR産物の量を蛍光値として検出するために、ABI社が開発したもの。鋳型となるDNA塩基配列のうちプライマーで挟まれている部分（PCRで増幅される部分）と相補的な塩基配列を持つヌクレオチドに、蛍光プローブ（レポーター）が結合している。また、PCR産物の量を反映する分だけ蛍光が検出されるようにする目的でクエンチャーが、Tm値を制御する目的でMGB (minor groove binder) 構造が結合している。
※ AB TaqMan Gene Expression Services
※ TaqMan - Wikipedia
・SYBR Green
TaqManプローブを使わずにPCR産物を定量するために利用できる蛍光色素。二本鎖DNAにインターカレートすると蛍光を発するため、その蛍光量を検出することにより、PCR反応により合成された二本鎖DNAを定量することができる。ただし、このときSYBR Greenの蛍光はPCR産物の配列に非特異的に生じるため、PCR反応で得られた増幅産物が目的の配列のものであるかどうかを反応後に確認する必要がある。この確認は、リアルタイムPCRシステムで増幅産物の解離曲線を作成するか、アガロースゲル電気泳動によりPCR産物のバンドを得ることにより行うことができる。
※ SYBR Green I
※ SYBR Green Iを用いたリアルタイムPCRの検討（タカラバイオ株式会社）
※ リアルタイムPCR解析（タカラバイオ株式会社）
・解離曲線
溶液中の二本鎖DNAの量と温度との関係を表した曲線。溶液の温度を上げていくと、二本鎖に会合しているDNAは一本鎖になっていく。一方で、SYBR Greenは二本鎖DNAにインターカレートしたときに蛍光を発する。そのため、SYBR Greenを含むDNA溶液の温度を上げていくと溶液中の蛍光量は低下していく。
一般的に、SYBR Greenを使った定量的PCRでは、PCR反応後に温度と蛍光量との関係を示す曲線を作成してPCR産物が単一であるかどうかを確認する。この方法では、プローブの蛍光量がPCR反応の特異性を保証しないためである。この確認に解離曲線を用いることができる。PCRが望み通りに進み反応産物である二本鎖DNAが単一である場合には、ある一定の温度で蛍光量が急激に変化する。逆に、非特異的な増幅やプライマーダイマーが形成された場合には、それぞれ特徴の異なる解離曲線が描かれる。そのため、解離曲線の形をPCR反応の妥当性を判断するための一指標とすることができるのである。
・鋳型DNAとしての逆転写産物の持ち込み量
RNAから逆転写して得た逆転写反応液（cDNA溶液）を鋳型DNAとして定量的PCRを行う場合、逆転写反応の条件にもよりますが、逆転写反応液を何倍か以上に希釈して行うことが推奨される。これは、逆転写反応に用いた酵素やプライマーがPCRの定量性に影響することがあるためである。これよりもcDNAが濃い条件で定量的PCRを行いたい場合には、cDNAをフェノール処理やエタノール沈殿により精製すればよい。
※ 参考
プライマーの設計（2008年4月13日）
